سلام بچه ها:
اگه یادتون باشه چهارشنبه استادفراشاهی سرکلاس آز زسیت درمورد( تکنیک pcr) توضیح داد من که سر کلاس خوب متوجه نشدم برای همین ازاینترنت مطالبی روپیدا کردم که خیلی بهمکمک کرد .
حالا منم خلاصه ای ازاین مطالبو تو این وب میذارم امیدوارم براتون مفید باشه.
تکنیک pcr: polymeras chain reaction (واکنشهای زنجیره ای پلیمراز )
Pcr تکنیکی است برای تکثیریک توالی خاص ازژن یک موجود زنده که مورداستفاده قرارمیگیرد.
پرایمرها:برای انجام عمل pcrنیازبه پرایمرها داریم.پرایمرهای pcrبه صورت کاملا اختصاصی و مکمل ناحیه موردنظرDNAهدف طراحی قرارمیگیرند.پرایمرها 20تا30باز دارند. نرم افزارهایی وجود دارندکه طراحی پرایمرها رابرعهده دارند.
برای طراحی پرایمرها توالی نوکلوئیدی موردنظرچند موجودزنده رابایکدیگر مقایسه می کنیم ونوکلئوتیدی که ازهمه بیشتراست رانوکلوئوتیدپرایمر انتخاب می کنیم. اگرهرچندبازی که باهم
مقایسه میکنیم مثل هم باشدبازی راکه با همه بازهای درحال مقایسه مطابقت دارد انتخاب میکنیم.
اگرژن موردنظرما دردسترس نباشد ازروی اینترنت ژنی مشابه ژنی که میخواهیم استخراج میکنیم واز روی آن ژن پرایمر راتهیه میکنیم. در pcrچون دورشته DNAداریم دونوع پرایمرنیز مورد استفاده قرارمیگیرد.
عمل پرایمرها:1-عمل ژنی که باید تکثیرشودرامشخص میکند.
2-اندازه قطعات تکثیرشونده راتعیین میکند.
درمودرگزینه دوم به این صورت میباشدکه وقتی دوشته پرایمر به دوناحیه مختلف DNAوبه سمت هم قرار میگیرند DNAپلی مراز قطغاتی راکه بین این دوقراردارند همانندسازی میکنند وبدین ترتیب طول قطعات ساخته شده تعیین میشود.
نحوه عملکرد pcr:برای انجام این تکنیک DNAالگو پرایمرها ونوکلئوتید تری فسفاتها وDNAپلی مراز رادریک لوله باهم مخلوط میکنیم.
درpcr3مرحله اساسی وجوددارد:
1-denaturation :دراین مرحله باگرم کردن لوله تادمای 94درجه به مدت 20تا30ثانیهدورشته ی DNAالگو وپرایمرها ازیکدیگرجدا میشوند این جداشدن ازطریق ازبین رفتن باندهای هیدروژنی بین نوکلئوتیدهای دورشته DNAالگو وپرایمرها صورت میگیرد.
2-anneling: دراین مرحله دمای واکنش به 50تا60درجه به مدت 20تا40ثانیه کاهش میابد تا امکان اتصال DNAپلی مراز وپرایمر به DNAالگو که حالت تک رشته ای است فراهم آورد. چون درپرایمرها توالی نوکلئوتیدی کوتاه تری وجوددارد دراین مرحله پرایمرها سریع تر ازرشته دیگر DNAبه آن می چسبد.به طورمعمول درجه حرارت اتصال 3تا5درجه کمتراز درجه حرارت ذوب شدن پرایمر استفاده می شود .هم چنین حساسیت پرایمرها برای چسبیدن به توالی نوکلئوتیدی DNAتک رشته ای پایین است.
3-extension:این مرحله اساسی ترین مرحله است زیرا فعالیت آنزیم شروع میشود . درجه حرارت این مرحله بسته به درجه حرارت آنزیم پلی مراز میباشد. دراین مرحله آنزیم پلی مراز نوکلئوتیدهای مکمل رابراساس رشته الگو درکنار هم قرارداده ودر نهایت رشته مکمل رشته الگوی اولیه راتولید می کند. مدت زمان این مرحله به پلی مرازوطول رشته DNAالگوبستگی دارد.
محصول pcrعبارت است ازقطعه ی همانندسازی شده ای که دوطرف این قطعه سکانس پرایمرها وجود دارند.
به طورمعمول هر عمل pcrبه 20تا40سیکل نیاز دارد.درپایان هرسیکل تعداد نسخه هایی که ازژن ساخته میشود زیاد میشود به طور کلی پس از nسیکل مادر محلول n2نسخه ازژن موردنظرخواهیم داشت.تعدادDNAهای کوتاه (رشته هایی که بین دو پرایمر محصورهستند)به صورت تصاعدی وDNAهای بلند یعنی رشته های که از یک طرف توسط یک پرایمر محدود هستند وازسمت دیگر نامحدود میباشند به صورت تصاعد حسابی زیاد میشوند.
کاربردهای pcr:
به طورکلی pcrبه دومنظور اصلی به کاربرده میشود:1-تهیه نسخه های متعدد:مانند تعیین میزان کراسینگ اور –تعیین فاصله بین ژنها-بررسی پیوستگی ژنهاو...اشاره کرد.
2- بررسی حضوریاعدم حضور یک ژن خاص دریک قطعه DNA:مانندتشخیص بیماریهای ژنتیکی قبل ازتولد-تعیین جنسیت جنین-بررسی عفونت های باکتریایی و ویروسی –تشخیص جهش ها وسرطان هاو...
پایان
امیدوارم این مطالب تونسته باشه اطلاعات خوبی در مورد این تکنیک دراختیارتون گذاشته باشه خوشحال میشم اگه نظراتونو برام بفرستید -مرسی